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What's New in protease inhibitor

LPS 投与モデルにおける低体温・生存期間とプロテアーゼインヒビター

足立裕史

Surgery Frontier Vol.18 No.1, 103-108, 2011

Summary
 ナファモスタットメシル酸塩(NM)はプロテアーゼインヒビターとして優れた抗凝固作用を有するが,重篤な全身性の炎症や敗血症に合併する播種性血管内凝固症候群に対して,抗凝固作用とともに,早期にその過剰な炎症反応を抑制している可能性が報告されるようになった。筆者は以前より無麻酔・非拘束条件での動物実験モデルにリポ多糖(lipopolysaccharide:LPS)を投与してエンドトキシンショック発症時の影響を調べてきたが,NMは外科手術後自由行動下のマウスにおいてもLPS投与後の体温恒常性維持期間を延長し,予後の改善につながる結果を得た。NMの有用性は臨床でも広く認められているが,今後,より早期の投与が全身状態の改善,治療に役立つと考えられた。

Key words
ナファモスタットメシル酸塩,プロテアーゼインヒビター,体温,リポ多糖,エンドトキシンショック

 ナファモスタットメシル酸塩(nafamostat mesilate:NM)は本邦で開発されたプロテアーゼインヒビターであり1),その短時間作用型の抗凝固作用2)3)に注目して,透析や血液濾過時の抗凝固剤としてしばしば使用されている4)。一般的にはヘパリンを用いるが,救急,集中治療領域において,特に合併症を有したハイリスク症例にはNMが選択されることが多い2)5)。その理由の1つとして,ヘパリンに比較して全身的な出血傾向を来し難い特性が挙げられている5)。一方で,NMが全身的な凝固能異常,特に敗血症を併発した症例において,播種性血管内凝固症候群(disseminated intravascular coagulation:DIC)治療に有効である可能性が多く報告されてきた6)7)。急速に進行する産婦人科領域のDICにも対しても有用とする報告が多い8)9)。また,類似のプロテアーゼインヒビターであるシベレスタットナトリウムも,DICを合併した症例の死亡率を改善する可能性が示されている10)。しかし,その有効性に関する基礎的な研究について,in vitroでの研究は多いものの11)12),in vivoの動物実験によって具体的にDICを改善することを明確に証明した実験は見られない。
 DICは臨床の場面では高度の炎症性疾患,特に敗血症の合併症として生じ,死亡率を大きく上昇させる13)。この炎症性疾患,敗血症に対する治療を研究するために,過去には不活化した菌体を注入した動物実験モデルが活用されたが14),近年では,精製された菌体毒素であるリポ多糖(lipopolysaccharide:LPS)を投与して全身性の炎症ならびに敗血症,ひいてはDICを発症させる手法が一般的に用いられている15)16)。そして惹起されたDIC動物の各種メディエーター,例えば炎症性サイトカイン産生や,微小循環における白血球の遊走能等が詳しく調べられてきた。しかし,in vivoの動物個体にLPSを投与して,動物の生存時間,生存率を調べるような実験はやはり少なかった。近年,Slofstraら17)はマウスを用いたin vivoの実験系を用いて,低分子ヘパリンが全身性の炎症,DICによる多臓器不全を減弱し,生存率を改善すると報告した。同じSlofstraら18)は,全身性の炎症とDICに繋がる多臓器不全発症までのシグナリングにプロテアーゼ活性化受容体4 (protease-activated receptor 4)の関与を証明しており,in vivoの動物実験でも全身性の炎症を軽減させることが,DIC予防,あるいはその治療につながる可能性を示唆している。
 NMがDICの治療に有効である可能性は高いと考えられるが,その早期投与の重要性が臨床の場面で強調されていることを考えると6)-9),NMはDICに至る前の全身性の炎症を減弱し,多臓器不全,DIC発症までの時間を延長している可能性が推測される。実際,敗血症のモデル動物においても,LPS投与直後は生体の生命維持恒常性が保たれるが,やがて破綻していくことがよく知られている15)。このような変化は,in vitroの実験系でとらえることは困難で,臨床的知見と基礎的,科学的理論を結び付けるためには,動物実験であってもin vivoの,極力臨床的条件に近い実験系での研究成果が求められる。
 筆者ら19)は以前にマウスを用いた実験で,エンドトキシンショックが心拍数の揺らぎに及ぼす影響を検討した。これは,同教室の中島ら20)21)が研究していた腸管循環に対するエンドトキシンショックの影響を無麻酔,非拘束条件のマウスで観察するための予備研究であったが,この際,テレメトリー法で記録されるマウスの体温変化に1つの特徴が観察された22)。それは,無麻酔,非拘束条件のマウスにLPSを投与すると,投与後1~3時間で軽度の体温上昇と復温が起こり,その後しばらく安定しているが,30時間程度が経過すると突然高度の体温低下が心拍数低下とともに認められた(図1)。

マウスの体格に比較してテレメトリーの送信器が巨大なため,腹腔内に埋め込んであっても,循環状態が不全の際には末梢温に近い体温が測定されているものと考えられたが,この体温変化は敗血症性ショック時に生じる二相性の変化,warm shockと,その後続発するcold shockそのものを反映しているといえる23)。
 体温調節の恒常性は,麻酔,特に全身麻酔によって大きく影響される24)。臨床的にも麻酔科の領域を中心に熱の再分布と体温低下は極めてよく知られており25),麻酔は体温の恒常性,中でも熱産生を減弱させる26)。体温を観察する動物実験においては,一般にこの実験手技上の制限が結果の解釈を若干ながらも難しくさせるが,著者ら19)は無麻酔,非拘束条件のマウスにおいても,敗血症性ショックと,続発するDICに関連して,循環不全に伴う体温の低下,そして,一定の間隔の後に死亡が生ずることから,この体温低下が生じるまでの時間に注目し,LPSを投与したマウスの体温恒常性維持にNMが有効ではないかとの仮説を立て,さらに実験を行った。
 実験の内容を簡単に紹介する22)。8週齢のオスC57/BL6マウス(28~32 g)を用い,8つの群(各群n=6)を設定した。セボフルラン麻酔下にテレメトリー送信機を準清潔的な操作で腹腔内へ埋め込んだ。最初の4群は埋め込み手術終了時に生理食塩水,あるいは大腸菌(O127:B8)由来のLPSを0.3mg/kg,1mg/kg,および3mg/kg,それぞれ皮下に投与した。次の3群は,LPS 3 mg/kgの投与と同時に,NMを1mg/kg,3mg/kgおよび10 mg/kg,対側の皮下に投与した。最後の群は比較のため,NM 10mg/kgのみを投与した。手術はすべて10分間程度で終了し,同時にセボフルラン投与を中止して覚醒させた。3分以内に自発行動が認められ,72時間後まで自由行動下に体温,心拍数をモニターした。室温を25度前後に保ち,体温が30度に低下するまでの時間,および,死亡するまでの時間を記録し,結果はANOVAを用い,p値が0.05以下になったものを有意とした。
 このマウス外科手術モデルにおいて,LPSは量依存性に術後の低体温を来すまでの時間を短縮し,対照群と比較して,1mg/kgおよび3mg/kgの投与で有意な差異を認めたほか,NMの同時投与は,3 mg/kgのLPS投与によって短縮した低体温を来すまでの時間を量依存性に延長した(図2)。

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