抗酸菌の分子疫学

Ⅰ．分子生物学的手法による結核菌型別

　結核菌の生化学的性質は種としてほぼ均一であり，ほとんどの結核菌はすべての薬剤に感受性であることから，表現型によるタイピング（Phenotypic Typing）で種（Species）より下の株（Strain）のレベルでの識別を行おうと思っても，十分な識別能が得られない。さらにゲノム構造的にも種としてはほぼ単相である。そこである程度識別力の高い遺伝子タイピング法（Genotypic Typing）が必要となる。具体的な使用目的は，主に個別の菌株の特定（感染経路の解明など）と，進化過程においてある程度まとまった性質を有する集団としての系統の解析（病原性評価など）ということになる。
　結核菌の遺伝子タイピング法にはいくつかあるが，初期には制限酵素によってゲノムを消化した際に発生する遺伝子長の多型（Restriction Fragment Length Polymorphisms；RFLP）がよく用いられ，近年まで基本的にゴールドスタンダードと考えられてきた。結核菌で一般的なのはInsertion Sequence（IS：挿入配列）6110を用いたタイピング法である1）。これは結核菌のゲノム中に不規則に入り込んでおり（しかしながらランダムではないと考えられている2）3）），そのなかにいくつかの制限酵素認識部位をもっている。結核菌から抽出したDNA（2～3μg）を適当な制限酵素（通常pvuⅡ）で切断すると，IS6110の数と存在部位によって切断されたDNAの断片長に多型性を生じる。これを電気泳動すると，数と長さ（サイズ）の異なる縞状のパターンとなる。一般に結核菌の場合IS6110の数は0～25個（通常8～20個）である。培養菌を使用することが前提なので時間がかかり，さらにISの数が5以下の場合，識別能が低くなってしまう。
　これらの難点を補うために，Clustered Regularly Interspersed Short Palindoromic Repeats（CRISPRs）やVariable Number Tandem Repeat（VNTR）がPCRベースで迅速に使用可能である。前者はスポリゴタイピング（Spacer Oligo-nucleotide typing；Spoligotyping）がよく知られている。スペーサーのある・なしにより43個の「点」からなるデジタルな情報が得られるが，東アジア地域で一般的なBeijing typeの結核菌で1～34番目までのスペーサーがすべて陰性となり，結果として識別能が低くなる。最近では結核菌の系統（Lineage）の型別や結核菌とM. bovisの鑑別に利用されている4）。
　現在遺伝子タイピングの主流となっているのは，いわゆる反復配列多型（VNTR）による方法である。これはゲノム中に存在する数～数十塩基を1単位とする繰り返し配列で，それぞれのVNTRローカスの前後にプライマーを設計してPCRで全体を増幅し，産物のサイズから反復コピー数を算出する。それぞれのVNTRローカスにおける反復配列の数には多型性があり，それぞれのコピー数を羅列することで数列によるプロファイルが得られる（桁数は使用するローカスの数によって決まる）（図）。

Supplyらは15ローカスのVNTR分析および24ローカスのVNTR分析を標準分析法として提唱している5）。この分析法は， 通常15-loci VNTR法で菌の分析を行い，高い分解能が必要な場合は，さらに9-lociを加えた合計24-lociの分析を行うという結核菌型別法である。VNTRはデータがデジタルであるため共有や解析が容易であり，PCRを利用するため塗抹陽性の臨床検体からの直接実施も可能である。
　次世代の遺伝子タイピング法として考えられているのは，全ゲノム解析（Whole Genome Sequence；WGS）である。系統の同定や個別菌株の微小な変異に関する情報を得ることができる。たとえばWGSの情報から一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphisms；SNPs）が特定できるが，これは文字通りゲノム塩基配列の1塩基の違いによる多様性であり，集団内で1%以上の頻度でみられる場合とされる（それ未満の場合は変異）。Niemannらはウズベキスタンで同じIS6110-RFLPを共有しながら多剤耐性と非多剤耐性（全感受性）である2株をWGS解析し，130のSNPsを同定している。このうち55SNPsは感受性株に，75SNPsは多剤耐性株に特異的な一塩基多型であったと報告されている6）。またSchürchらは1992年から始まったアウトブレイクで分離された結核菌株のうち，IS6110-RFLPパターンが同じ3株の全ゲノム解析を行って8つのSNPsを特定し，104株の感染経路を明らかにしている7）。SNPs解析にはリアルタイムPCRやパイロシークエンシング法が利用できる。
　その他，Large Sequence Polymorphisms（LSPs）あるいはRegions of Difference（RD）と呼ばれるやや大きな遺伝子の欠失（Deletion）を基にした遺伝子タイピング法もあり，系統解析などに利用される8）（表）。

Ⅱ．結核菌分子疫学の公衆衛生上の有用性

　結核菌の分子疫学的手法の応用として，以下のようなことが考えられる。